Risposta elettrica di cellule cardiache isolate 
a stimoli meccanici indotti con diversi metodi 
di rigonfiamento cellulare 

Nicola Biondetti

Relatori: R Antolini, F Ravelli
Tesi di Laurea in Fisica (Corso di Laurea quadriennale)
Università di Trento, 2000. 


Abstract

L’attività elettrica della cellula cardiaca si manifesta in seguito all’arrivo di un impulso elettrico che determina la contrazione meccanica attraverso il meccanismo d’eccitazione-contrazione. Le cellule ventricolari, in assenza d’eccitazione, mantengono un potenziale elettrico di riposo stabile che subisce una rapida variazione in seguito all’arrivo di un impulso sopra-soglia. Il potenziale d’azione è il risultato di una sequenza specifica di movimenti ionici che sono controllati dall’apertura e dalla chiusura sequenziale di canali selettivi di conduzione attraverso la membrana cellulare. Risulta interessante nell’ambito dello studio delle proprietà elettriche della cellula cardiaca il meccanismo inverso di contrazione-eccitazione, secondo il quale modificazioni meccaniche, quali ad esempio lo stiramento ed il rigonfiamento, inducono variazioni nell’attività elettrica. Lo studio delle alterazioni elettriche in seguito a rigonfiamento cellulare ci può infatti mostrare come la dilatazione del tessuto cardiaco possa favorire l’insorgenza di aritmie.
In questo lavoro si è studiato il comportamento elettrofisiologico della cellula cardiaca isolata sottoposta a rigonfiamento effettuato con due diversi metodi: osmotico e diretto. Il rigonfiamento osmotico è stato indotto superfondendo il miocita con una soluzione ad attività osmotica inferiore a quella del mezzo intracellulare, provocando quindi l’entrata di acqua all’interno del miocita cardiaco con conseguente aumento delle dimensioni cellulari. Il rigonfiamento diretto è stato invece effettuato inserendo all’interno della cellula una quantità di soluzione, di composizione simile a quella presente all’interno della cellula.
Lo studio dei parametri elettrici della membrana cellulare è stato reso possibile grazie alla tecnica del patch clamp mediante la quale siamo stati in grado di instaurare un contatto elettrico diretto tra un microelettrodo e l’interno della cellula e di effettuare successivamente misure del potenziale di membrana. Oltre alle misure elettrofisiologiche cellulari, un sistema di acquisizione di immagini collegato ad una telecamera ci ha permesso di registrare le immagini relative alla cellula durante le varie fasi dell’esperimento. A partire dalle singole immagini, acquisite ad intervalli di 15 secondi, siamo stati in grado di eseguire un’analisi sulle immagini cellulari attraverso un programma di elaborazione grafica, che ci ha permesso di determinare il valore dei principali parametri morfologici delle cellule tra cui il volume.
L’esposizione delle cellule ad un mezzo ipo-osmotico (0.6T) ne determina il rigonfiamento; in particolare l’aumento da noi registrato è stato in media pari al 26.7±5.3%. Le cellule hanno risposto a questo rigonfiamento con una depolarizzazione del potenziale a riposo di 4.2±0.3mV pari al 6.0±0.3% ed un accorciamento della durata del potenziale d’azione da 320±23ms a 257±18ms, con una variazione del 27.5±3.8%. In seguito abbiamo confrontato le cinetiche di variazione del potenziale a riposo, della durata del potenziale d’azione e del volume, indotte dal rigonfiamento cellulare. Lo studio ha rivelato che le cause che portano alle variazione dei due parametri elettrici da noi considerati possono essere diverse in quanto le curve di variazione, all’aumento del volume e al suo ritorno ai valori di controllo, mostrano andamenti temporali diversi. In particolare il potenziale a riposo rispondeva con una variazione a gradino alle modifiche dell’osmoticità della soluzione extracellulare. L’andamento di queste variazioni sembra quindi riflettere il cambiamento rapido nel valore della concentrazione del potassio intracellulare, causato dall’entrata di acqua all’interno della cellula, da cui dipende principalmente il valore del potenziale a riposo. Lo studio dell’andamento delle fasi di ripolarizzazione ha mostrato che la diminuzione della durata del potenziale d’azione è determinata principalmente da una significativa diminuzione nella durata della fase 2 pari in media al 23.5±1.5% e da un aumento nella durata della fase 3 pari al 7.0±1.3%. Questo effetto può essere imputato all’attivazione della corrente cloro che rappresenta la principale corrente stretch-attivata ed il cui potenziale d’inversione caratterizza la sua diversa influenza nelle varie fasi del potenziale d’azione. 
Le variazioni osservate nelle proprietà elettriche a seguito del rigonfiamento osmotico sono dovute all’attivazione delle correnti stretch attivate ed alla diluizione dei componenti intracellulari. Si è quindi cercato di separare le due cause per approfondire l’effetto diretto dello stretch sui canali ionici, responsabili della corrente cellulare. Questo è stato possibile inserendo nella cellula una quantità di soluzione di composizione simile a quella presente all’interno della cellula stessa, effettuando quindi un rigonfiamento diretto. In tal modo le variazioni all’attività elettrica non sono più da attribuire alla diluizione dei soluti intracellulari ma unicamente all’attivazione ed alla modificazione delle correnti ioniche stretch-attivate.
In seguito al rigonfiamento diretto l’aumento del volume è risultato pari al 25.3±6.7%. Lo stiramento diretto della membrana del miocita ha causato un’alterazione del potenziale di membrana. Ad una depolarizzazione del potenziale a riposo pari in media a 1.7±0.4%, seguiva un accorciamento del potenziale d’azione pari a 16.7±5.0%. 
Queste variazioni dei due parametri elettrofisiologici, indotte dal rigonfiamento cellulare, sono quindi da attribuire unicamente all’attivazione di correnti stretch-modulate. A questo punto si è cercato di fare delle ipotesi sulle correnti responsabili delle variazioni del potenziale di membrana in seguito a rigonfiamento diretto. Diversi studi hanno verificato che la depolarizzazione osservata è dovuta principalmente all’attivazione della corrente cloro che durante il potenziale a riposo ha un effetto depolarizzante, dal momento che il potenziale di membrana è inferiore al potenziale di equilibrio per il cloro. La corrente cloro è anche la principale responsabile dell’accorciamento nella durata del potenziale d’azione unitamente al contributo della corrente potassio che alcuni studi hanno dimostrato subire un aumento in seguito allo stretch della membrana. Un confronto finale fra i risultati ottenuti con le due tecniche di rigonfiamento cellulare ci ha inoltre permesso di fare una stima del contributo effettivo della diluizione dei componenti intracellulari e delle correnti stretch attivate alle variazioni delle proprietà elettriche. 
In conclusione lo studio delle variazioni dell’attività elettrica della cellula cardiaca isolata in seguito a rigonfiamento ci può aiutare a capire i meccanismi alla base delle aritmie cardiache che si sviluppano in cuori dilatati o ingrossati.