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Abstract
L’attività elettrica della
cellula cardiaca si manifesta in seguito all’arrivo di un impulso elettrico
che determina la contrazione meccanica attraverso il meccanismo d’eccitazione-contrazione.
Le cellule ventricolari, in assenza d’eccitazione, mantengono un potenziale
elettrico di riposo stabile che subisce una rapida variazione in seguito
all’arrivo di un impulso sopra-soglia. Il potenziale d’azione è
il risultato di una sequenza specifica di movimenti ionici che sono controllati
dall’apertura e dalla chiusura sequenziale di canali selettivi di conduzione
attraverso la membrana cellulare. Risulta interessante nell’ambito dello
studio delle proprietà elettriche della cellula cardiaca il meccanismo
inverso di contrazione-eccitazione, secondo il quale modificazioni meccaniche,
quali ad esempio lo stiramento ed il rigonfiamento, inducono variazioni
nell’attività elettrica. Lo studio delle alterazioni elettriche
in seguito a rigonfiamento cellulare ci può infatti mostrare come
la dilatazione del tessuto cardiaco possa favorire l’insorgenza di aritmie.
In questo lavoro si è studiato
il comportamento elettrofisiologico della cellula cardiaca isolata sottoposta
a rigonfiamento effettuato con due diversi metodi: osmotico e diretto.
Il rigonfiamento osmotico è stato indotto superfondendo il miocita
con una soluzione ad attività osmotica inferiore a quella del mezzo
intracellulare, provocando quindi l’entrata di acqua all’interno del miocita
cardiaco con conseguente aumento delle dimensioni cellulari. Il rigonfiamento
diretto è stato invece effettuato inserendo all’interno della cellula
una quantità di soluzione, di composizione simile a quella presente
all’interno della cellula.
Lo studio dei parametri elettrici
della membrana cellulare è stato reso possibile grazie alla tecnica
del patch clamp mediante la quale siamo stati in grado di instaurare un
contatto elettrico diretto tra un microelettrodo e l’interno della cellula
e di effettuare successivamente misure del potenziale di membrana. Oltre
alle misure elettrofisiologiche cellulari, un sistema di acquisizione di
immagini collegato ad una telecamera ci ha permesso di registrare le immagini
relative alla cellula durante le varie fasi dell’esperimento. A partire
dalle singole immagini, acquisite ad intervalli di 15 secondi, siamo stati
in grado di eseguire un’analisi sulle immagini cellulari attraverso un
programma di elaborazione grafica, che ci ha permesso di determinare il
valore dei principali parametri morfologici delle cellule tra cui il volume.
L’esposizione delle cellule ad un
mezzo ipo-osmotico (0.6T) ne determina il rigonfiamento; in particolare
l’aumento da noi registrato è stato in media pari al 26.7±5.3%.
Le cellule hanno risposto a questo rigonfiamento con una depolarizzazione
del potenziale a riposo di 4.2±0.3mV pari al 6.0±0.3% ed
un accorciamento della durata del potenziale d’azione da 320±23ms
a 257±18ms, con una variazione del 27.5±3.8%. In seguito
abbiamo confrontato le cinetiche di variazione del potenziale a riposo,
della durata del potenziale d’azione e del volume, indotte dal rigonfiamento
cellulare. Lo studio ha rivelato che le cause che portano alle variazione
dei due parametri elettrici da noi considerati possono essere diverse in
quanto le curve di variazione, all’aumento del volume e al suo ritorno
ai valori di controllo, mostrano andamenti temporali diversi. In particolare
il potenziale a riposo rispondeva con una variazione a gradino alle modifiche
dell’osmoticità della soluzione extracellulare. L’andamento di queste
variazioni sembra quindi riflettere il cambiamento rapido nel valore della
concentrazione del potassio intracellulare, causato dall’entrata di acqua
all’interno della cellula, da cui dipende principalmente il valore del
potenziale a riposo. Lo studio dell’andamento delle fasi di ripolarizzazione
ha mostrato che la diminuzione della durata del potenziale d’azione è
determinata principalmente da una significativa diminuzione nella durata
della fase 2 pari in media al 23.5±1.5% e da un aumento nella durata
della fase 3 pari al 7.0±1.3%. Questo effetto può essere
imputato all’attivazione della corrente cloro che rappresenta la principale
corrente stretch-attivata ed il cui potenziale d’inversione caratterizza
la sua diversa influenza nelle varie fasi del potenziale d’azione.
Le variazioni osservate nelle proprietà
elettriche a seguito del rigonfiamento osmotico sono dovute all’attivazione
delle correnti stretch attivate ed alla diluizione dei componenti intracellulari.
Si è quindi cercato di separare le due cause per approfondire l’effetto
diretto dello stretch sui canali ionici, responsabili della corrente cellulare.
Questo è stato possibile inserendo nella cellula una quantità
di soluzione di composizione simile a quella presente all’interno della
cellula stessa, effettuando quindi un rigonfiamento diretto. In tal modo
le variazioni all’attività elettrica non sono più da attribuire
alla diluizione dei soluti intracellulari ma unicamente all’attivazione
ed alla modificazione delle correnti ioniche stretch-attivate.
In seguito al rigonfiamento diretto
l’aumento del volume è risultato pari al 25.3±6.7%. Lo stiramento
diretto della membrana del miocita ha causato un’alterazione del potenziale
di membrana. Ad una depolarizzazione del potenziale a riposo pari in media
a 1.7±0.4%, seguiva un accorciamento del potenziale d’azione pari
a 16.7±5.0%.
Queste variazioni dei due parametri
elettrofisiologici, indotte dal rigonfiamento cellulare, sono quindi da
attribuire unicamente all’attivazione di correnti stretch-modulate. A questo
punto si è cercato di fare delle ipotesi sulle correnti responsabili
delle variazioni del potenziale di membrana in seguito a rigonfiamento
diretto. Diversi studi hanno verificato che la depolarizzazione osservata
è dovuta principalmente all’attivazione della corrente cloro che
durante il potenziale a riposo ha un effetto depolarizzante, dal momento
che il potenziale di membrana è inferiore al potenziale di equilibrio
per il cloro. La corrente cloro è anche la principale responsabile
dell’accorciamento nella durata del potenziale d’azione unitamente al contributo
della corrente potassio che alcuni studi hanno dimostrato subire un aumento
in seguito allo stretch della membrana. Un confronto finale fra i risultati
ottenuti con le due tecniche di rigonfiamento cellulare ci ha inoltre permesso
di fare una stima del contributo effettivo della diluizione dei componenti
intracellulari e delle correnti stretch attivate alle variazioni delle
proprietà elettriche.
In conclusione lo studio delle variazioni
dell’attività elettrica della cellula cardiaca isolata in seguito
a rigonfiamento ci può aiutare a capire i meccanismi alla base delle
aritmie cardiache che si sviluppano in cuori dilatati o ingrossati.
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